Ce soir-là, Mathilde Stangerson avertit son père qu'elle dormira encore cette nuit dans la chambre jaune du pavillon attenant au château. Alors que M. Stangerson, un savant, se livre d’étranges travaux dans un laboratoire contigu, il entend soudain d'atroces hurlements et des coups de revolver. Il se précipite vers la chambre jaune, dont la porte est fermée. Avec l'aide du Père Jacques, II enfonce la porte et trouve sa fille Mathilde, inanimée, des marques de strangulation au cou, un filet de sang à la tempe. Mais pas la moindre trace de l'agresseur. Comment celui-ci a-t-il pu s'introduire et sortir de la chambre jaune, hermétiquement close, verrouillée de l'intérieur et dont la fenêtre est protégée par de puissants barreaux ? Le journaliste Rouletabille qui réussit à se faire inviter par le professeur Stangerson, mène l'enquête parallèlement au célèbre policier Larsan. Enquête difficile, car la jeune fille, apparemment terrorisée, affirme ne rien pouvoir dire sur son agresseur.