Родился 7 апреля 1922 года в посёлке Иващенково (ныне Чапаевск, Самарская область).

Служил в РККА с 1940 года в течение шести лет. Окончил Челябинское военное авиационное училище и Котласское военное аэросанное училище. На фронтах Великой Отечественной войны - с декабря 1941 года. Служил командиром боевых аэросаней в батальоне на Северо-Западном Сталиградском фронтах. В 1944 году получил ранение, последний год войны служил чертёжником. Демобилизован в 1946 году.

С 1947 по 1948 год учился в студии при Куйбышевском театре имени Горького, стал актёром этого театра и служил на этой сцене до 1972 года.

С 1972 года — во МХАТе имени М. Горького.

Манере Николая Засухина были присущи темперамент, мягкий юмор, стремление к внутреннему перевоплощению, пластичность и острый рисунок роли.

В многочисленной труппе МХАТа актёр работал меньше чем в Куйбышеве и после раскола театра ушёл в театр Т. В. Дорониной.

В кино Засухин снимался нечасто, играя преимущественно чиновников и партийных работников: заместитель председателя Совета министров СССР («Твой современник»), В. И. Ленин («Поезд в завтрашний день»), Смоленцев («Комитет 19-ти»), Владимир Шарапов («Гонки по вертикали»), Никодимов («Свой среди чужих, чужой среди своих»), Железненький («Развлечение для старичков»), Ковалёв («Легко быть добрым»). В ряде фильмов сыграл, благодаря внешнему сходству, В. М. Молотова.

Жена — актриса Нина Засухина (род. 1927), заслуженная артистка РСФСР.

Скончался 25 августа 1992 года. Похоронен в Москве на Ваганьковском кладбище.