L'équipe du NCIS recoit le concours de l'agent Michelle Lee, qui se montre vite ambiguë. Désireuse de bien faire, elle devient suspecte aux yeux des autres enquêteurs. D'autant plus qu'elle espionne Ziva David et nourrit des doutes sur son intégrité. Ziva David, qui traîne derrière elle son passé d'espionne du Mossad, doit toujours faire ses preuves.

Gibbs dopo aver risolto alcuni casi autonomamente ritorna a capo del team. Il filo conduttore della stagione è legato a Tony, che inizia una relazione seria con Jeanne, una giovane dottoressa. Nel frattempo, per richiesta del direttore Shepard, Tony inizia ad indagare sul trafficante di armi francese René Benoit, conosciuto anche come La Grenouille. Nell'ultimo episodio della stagione si scopre che Jeanne è la figlia del trafficante e che la relazione di Tony era solo una copertura per avvicinarsi a lui.

Specialagent Leroy Jethro Gibbs lämnade NCIS i slutet av säsong tre efter att en terroristattack hade varit framgångsrik eftersom hans överordnade inte lyssnade på hans varningar i tid. Laget leds nu av Anthony DiNozzo under en kort tid fram till Gibbs eventuella återkomst. Nya karaktärer som introducerades under den här säsongen är Michelle Lee, som en kort tid var med i DiNozzos team och överfördes till den juridiska avdelningen när Gibbs återvände, och (redan i de sista avsnitten av säsong 3) Gibbs tidigare chef och mentor Mike Franks, både som återkommande karaktärer. Också, om än senare under säsongen, introduceras överstelöjtnant Hollis Mann i Army CID som ett annat kärleksintresse för Gibbs.