Un padre divorciado trata de establecerse, impresionar a su hijo y encontrar su destino. Él se presenta para un trabajo como vigilante nocturno en el Museo Americano de Historia Natural de la ciudad de Nueva York y, posteriormente, descubre que los objetos expuestos, animados por un artefacto mágico de Egipto, vuelven a la vida durante la noche. Al principio le va muy mal tratando de mantener el orden y la calma en el museo, pero al final se vuelve muy buen amigo de todos y juntos ayudan a recuperar aquel artefacto mágico egipcio, ya que ha sido robado por los antiguos vigilantes del museo.

El vigilante jurado Larry Daley (Ben Stiller) se ve obligado a decir adiós a todos sus amigos cuando deciden hacer el Museo de Ciencias Naturales más "interactivo" y sustituyen todas las figuras por hologramas. Sus amigos históricos son empaquetados y enviados a los archivos del famoso Smithsonian, en Washington, DC., el museo más grande del mundo. No han pasado ni 24 horas cuando Larry recibe una llamada de Jedediah, el cowboy en miniatura, y descubre que la tabla de Ahkmenrah ha sido extraviada y esto ha hecho que el Smithsonian cobre vida. Para salvar a sus amigos, Larry tendrá que viajar a Washington, DC y luchar contra Kahmunrah, Al Capone, Iván el Terrible y Napoleón que han planeado un complot para apoderarse de la tabla. En medio del caos, Larry hará nuevos amigos, como Amelia Earhart o Albert Einstein que le ayudarán a detener el complot y salvar el museo.

La tabla de Ahkmenrah, la que hace que las estatuas de los museos cobren vida, está perdiendo su magia. En un intento desesperado para proteger el valioso tesoro, Larry Daley viajará junto a sus amigos Theodore Roosevelt -Robin Williams en su última película-, el faraón Ahkmenrah, Atila, Jebediah Smith, Augustus Octavius y Sacagawea desde Nueva York hasta Londres. Allí intentarán contactar con alguien del Museo de Londres que les ayude a restaurar la magia y conocerán a Sir Lancelot y otros personajes del antiguo Egipto.