Winona Laura Horowitz 1971. október 29-én született egy Winona nevű kis faluban, melyről nevét is kapta. Észak-Kaliforniában egy elszigetelt farmon nevelkedett, ahol áram sem volt. A színésznő a neves pszichológus és író Timothy Leary ükunokája. Szülei jó barátságot ápoltak a beat nemzedék egyik legikonikusabb alakjával, a költő Allen Ginsberggel. A család a farmról Petalumába (Kalifornia) költözött, ahol Whinona az American Coservatory Theater színészkurzusait látogatta. Tizenhárom évesen a Sivatagi felhő (1986) meghallgatására jelentkezett, és bár a szerepet nem kapta meg, felfigyelt rá a népszerű rendező, David Seltzer.

Ennek köszönhetően lehetőséget kapott Seltzer Lucas (1986) című filmjében, melyet a nagysikerű Beetlejuice - Kísértethistória (1988), majd a Tim Burton rendezésével bemutatott Ollókezű Edward (1990) követett. Winona ebben az időszakban Johnny Deppel alkotott egy párt, akit utóbbi filmje forgatásán ismert meg.

Johnny meg akarta kérni a lány kezét, de a szülei nem engedték, nem sokkal később pedig kapcsolatuk szakítással végződött. A színésznek volt egy tetoválása „Winona Forever” felirattal, melyet később „Wino Forever”-re változtatott.

Korai filmjei közül a legjelentősebbek a Éjszaka a Földön (1991) Jim Jarmusch rendezésében, a Drakula (1992) és Az ártatlanság kora (1993), melyért Golden Globe-díjat nyert.

2001-ben hatalmas botrányba került, amikor hozzávetőlegesen 5000 dollár értékben elcsent pár dolgot egy áruházból. A sajtóban több magyarázat is megjelent (kleptománia, nyugtatók hatása, stb.), mindenesetre az ügy nem tett jót Winona karrierjének, és pár évre visszavonult a nyilvánosságtól. 2002-ben még befejezte a Simone - Sztárcsináló 1.0 (2002) és a A kismenő (2002) című filmeket, ezt követően azonban néhány évig csak kisebb szerepeket vállalt.

2006-ban a Kamera által homályosan (2006) című filmmel tért vissza, melyben olyan színészek mellett láthattuk, mint Keanu Reeves, Robert Downey Jr. és Woody Harrelson. 2009-ben szerepelt a Star Trek (2009) és a Pippa Lee négy élete (2009) című sikerfilmekben, majd 2010-ben Darren Aronofsky drámájában, a Fekete hattyúban is láthattuk. Egy évvel később A dilemma (2011) című filmben tűnt fel Vince Vaughn oldalán, ezt követte a The Letter (2012) James Francóval, és a Harcban élve (2013).