Depois de sua segunda temporada, a NBC estava preparada para cancelar Star Trek devido aos baixos indíceis de audiência. Liderados pelos fãs Bjo e John Trimble, os telespectadores de Trek inundaram a NBC com cartas protestando contra o cancelamento da série e pedindo para a emissora renovar o programa para mais um ano. Depois da NBC ter concordado em produzir uma terceira temporada, ela prometeu a Gene Roddenberry que o programa iria ao ar em um horário favorável (segundas-feiras, às 19h30), porém mais tarde mudou a programação e colocou Star Trek no chamado "horário da morte" – sextas-feiras, às 22h00. Além da troca de horário na programação, o orçamento do programa foi "seriamente cortado" e Nichelle Nichols descreveu o eventual concelamento da série como "uma profecia auto-realizável" A temporada final de 24 episódios de Star Trek começou em setembro de 1968 com "Spock's Brain". A terceira temporada também inclui "The Tholian Web", onde Kirk fica preso entre dois universos; este episódio seria revisitado em 2005 no episódio em duas partes "In a Mirror, Darkly", da série prequela Star Trek: Enterprise. O último episódio da série, "Turnabout Intruder", foi exibido em 3 de junho de 1969, porém Star Trek acabaria por voltar a televisão na forma de animação quando Star Trek: The Animated Series estreou em setembro de 1973.